Promotor Gen (Promotor CP4 Mutant EPSPS) (promotor CaMV 35S ) (insektisida crystal protein?)

TUGAS BIOTEKNOLOGI PERTANIAN

1.                       Promotor CP4 Mutant EPSPS

Rekayasa tanaman transgenik resisten terhadap-spektrum herbisida glifosat telah meningkatkan efisiensi pertanian di seluruh dunia. Berbasis glifosat herbisida, seperti Roundup, target enzim jalur shikimate 5-enolpyruvylshikimate 3-fosfat (EPSP) sintase, fungsi yang benar-benar diperlukan untuk kelangsungan hidup tanaman. Roundup Ready tanaman membawa gen coding untuk suatu bentuk glifosat-insensitive enzim ini, diperoleh dari Agrobacterium sp. regangan CP4. Setelah dimasukkan ke dalam genom tanaman, produk gen, CP4 EPSP sintase, memberikan resistensi tanaman untuk glifosat. Meskipun banyak digunakan, dasar molekuler untuk ketahanan glifosat-tetap jelas menghasilkan sebuah gen sintetik coding untuk CP4 sintase EPSP dan ditandai enzim menggunakan kinetika dan kristalografi. Enzim memiliki sifat CP4 kinetik dan struktural tak terduga yang membuat unik di antara synthases EPSP dikenal. Glyphosate mengikat sintase EPSP CP4 dalam konformasi, kental noninhibitory. Glifosat sensitivitas dapat dikembalikan melalui mutasi tunggal-situs di situs aktif (Ala-100-Gly), yang memungkinkan glifosat untuk mengikat dalam diperpanjang konformasi, penghambatan.

The-spektrum yang luas herbisida glifosat, bahan aktif Roundup, menghambat 5-enolpyruvylshikimate-3-fosfat (EPSP) sintase, enzim katalisator langkah kedua terakhir dari jalur shikimate terhadap biosintesis asam amino aromatik. Roundup Ready baris tanaman mengandung gen yang berasal dari Agrobacterium sp. regangan CP4, pengkodean enzim glifosat-toleran, yang disebut sintase CP4 EPSP. Ekspresi sintase CP4 hasil EPSP di toleran glifosat tanaman, memungkinkan pengendalian gulma lebih efektif dengan memungkinkan aplikasi herbisida postemergent. Keuntungan besar-toleran glifosat tanaman telah menghasilkan adopsi yang cepat: 87% dari kedelai, 61% dari kapas, dan 26% jagung yang ditanam di Amerika Serikat pada 2005 adalah varietas yang toleran terhadap glyphosate. Namun, kekhawatiran berlama-lama tentang efek kesehatan dan lingkungan yang potensial dari organisme dimodifikasi secara genetik telah membatasi penerimaan garis benih tersebut dan produk makanan, khususnya di Eropa dan Jepang.

Sintase EPSP mengkatalisis transfer bagian enolpyruvyl dari phosphoenolpyruvate (PEP) dengan 5-hidroksil dari shikimate-3-fosfat (S3P). Dimulai pada awal 1980-an, peneliti berusaha untuk mengidentifikasi glifosat-sensitif synthases EPSP yang dapat diperkenalkan ke dalam tanaman untuk memberikan resistensi herbisida. Sejumlah enzim yang menjanjikan diidentifikasi melalui evolusi selektif, situs-diarahkan mutagenesis, dan layar mikroba. Namun, toleransi meningkat untuk glifosat dalam sintase EPSP sering disertai dengan penurunan bersamaan dalam afinitas enzim untuk PEP, menghasilkan efisiensi katalitik menurun. Karakteristik kinetik lebih menguntungkan diamati di beberapa enzim dengan substitusi termasuk Pro-101-Ser dan Thr-97-Ile (penomoran sesuai dengan Escherichia coli sintase EPSP). Akhirnya, alami toleran glyphosate-mikroba diidentifikasi, termasuk Agrobacterium sp. regangan CP4, Achromobacter sp. regangan LBAA, dan Pseudomonas sp. regangan PG2982. Enzim diisolasi dari bakteri ini ditunjuk sebagai kelas II EPSP synthases atas dasar efisiensi katalitik mereka di hadapan glifosat dan variasi urutan substansial mereka dibandingkan dengan synthases EPSP dari tanaman atau E. coli. Agrobacterium sp. regangan CP4, terisolasi dari kolom limbah-makan di fasilitas produksi glifosat, menghasilkan glifosat-tahan, kinetik efisien EPSP sintase yang cocok untuk produksi transgenik, tanaman toleran glifosat-. Lain kelas II EPSP synthases sejak telah dijelaskan, biasanya dari bakteri Gram-positif, termasuk spesies patogen seperti Streptococcus pneumonia dan Staphylococcus aureus.

Meskipun keberhasilan pertanian dan komersial besar tanaman rekayasa genetika, dasar molekuler untuk ketidakpekaan glifosat-enzim CP4 atau kelas II lainnya sintase EPSP tetap jelas. Memahami hambatan secara rinci molekul glifosat harus memfasilitasi optimasi atau penggantian baris tanaman yang ada. Selain itu, pengetahuan ini akan sangat berharga untuk desain rasional inhibitor novel sintase EPSP untuk memerangi munculnya gulma tahan glifosat-. Jadi, kita disintesis gen yang sesuai dengan urutan asam amino dipatenkan CP4 EPSP sintase, dioptimalkan untuk ekspresi dalam E. coli. Enzim wild type CP4 dan enzim mutan (Ala-100-Gly) yang ditandai oleh kondisi mapan kinetika dan struktur kristal, gratis dan liganded dengan S3P dengan atau tanpa glifosat, yang ditentukan pada 1.7-menjadi 2,1-Å resolusi

2.      promotor CaMV 35S
Analisis promotor CaMV 35 dibagi menjadi diskusi tentang:
• promotor sendiri
• urutan diidentifikasi dalam paten sebagai "daerah 35S penambah"
• yang "minimal" promotor
Promotor sendiri  Pada awal 1980-an, Chua dan kolaborator di Universitas Rockefeller terisolasi promotor bertanggung jawab atas transkripsi dari seluruh genom dari virus mosaik Kembang Kol (CaMV) menginfeksi lobak. Promotor bernama CaMV 35S promotor ("promotor 35S") karena koefisien sedimentasi dari transkrip virus yang ekspresinya secara alami didorong oleh promotor ini 35S. Ini adalah salah satu yang paling banyak digunakan untuk tujuan umum promotor konstitutif.
Promotor 35S adalah promotor konstitutif yang sangat kuat, menyebabkan tingginya tingkat ekspresi gen pada tanaman dicot. Namun, kurang efektif dalam monokotil, terutama dalam sereal. Perbedaan dalam perilaku mungkin karena perbedaan dalam kualitas dan / atau kuantitas faktor regulasi.
 Promotor bertanggung jawab untuk transkripsi bagian lain dari genom CaMV, para promotor CaMV 19s, juga digunakan sebagai promotor konstitutif, tetapi tidak seperti yang banyak digunakan sebagai promotor 35S.

Promotor CaMV lebih disukai di atas promotor potensial lainnya karena merupakan promotor lebih kuat daripada yang lain dan tidak sangat dipengaruhi oleh kondisi lingkungan atau jenis jaringan. CaMV memiliki dua Promotor 19s dan 35S, kedua promotor 35S paling sering digunakan dalam bioteknologi karena paling kuat. Promotor 35S adalah DNA (atau RNA) urutan sekitar 400 pasangan basa panjang. Penggunaan promotor CaMV pada tanaman adalah analog dengan penggunaan promotor LTR retrovirus dalam vektor retrovirus yang digunakan dalam terapi gen manusia. Mayoritas percobaan terapi gen manusia mempekerjakan promotor LTR untuk menyediakan motor untuk mengaktifkan gen.

3.                       insektisida crystal protein?

Peningkatan luas areal tanaman kapas Bt di USA pada 1996 mencapai 0,73 juta ha. Jika dijumlahkan, maka luas pertanaman kapas Bt mulai tahun 1996 sampai 2003 mencapai 23,3 juta ha. Tanaman transgenik Bt ditanam di beberapa Negara seperti di USA, Kanada, Argentina, Brasil, India, China, Filipina, dan beberapa negara lain termasuk Indonesia (James 2002; Saragih 2004). Tanaman transgenik Bt merupakan tanaman transgenik pertama yang dilepas di alam untuk komersial dan menempati urutan pertama dalam daftar tanaman transgenik tahan hama. Tanaman transgenic Bt merupakan hasil rekayasa genetik dengan mengintroduksi gen cry1A yang diisolasi dari bakteri gram positif B. thuringiensis. Bakteri B. thuringiensis adalah bakteri yang pada proses sporulasinya mengha-silkan kristal protein yang bersifat toksik dan dapat membunuh serangga (insektisidal) (Hofte dan Whiteley 1989). Kristal protein Bt yang bersifat insektisidal sering disebut dengan δ-endotoksin. Kristal ini di alam merupakan protoksin yang jika larut dalam usus serangga karena proses proteolisis akan diubah men-jadi polipeptida yang lebih pendek (27-149 kilo Dalton) serta mempunyai sifat insektisidal. Toksin aktif ini ber-interaksi dengan sel-sel epitel dari usus (midgut) se-rangga. Toksin Bt mengakibatkan terbentuknya pori-pori pada membran sel saluran pencernaan, sehingga mengganggu keseimbangan osmotik sel tersebut. Sel yang terganggu tekanan osmosisnya menjadi bengkak dan pecah, sehingga serangga mati (Hofte dan Whiteley 1989).

Pengetahuan tentang mekanisme kerja endotoksin Bt penting untuk menentukan proses utama yang bertanggung jawab terhadap kespesifikan dari suatu kristal protein. Faktor utama yang menentukan kisaran inang dari kristal protein adalah perbedaan pH di midgut larva yang mempengaruhi proses kelarutan (solubilization) dan pengubahan kristal yang tidak aktif menjadi aktif, serta keberadaan lokasi penempelan (binding-site) yang spesifik dari protoksin di dalam perut (gut) serangga (Lereclus et al. 1993). Bakteri B. thuringiensis mempunyai beberapa subspesies, yaitu subsp. kurstaki, aizawai, sotto, entomocidus, berliner, san diego, tenebroid, morrisoni, dan israelensis. Setiap subspesies Bt memiliki beberapa strain, seperti strain HD-1 dan HD-5. Suatu strain Bt pada umumnya memproduksi lebih dari satu jenis kristal protein. Gen yang menyandi pembentukan kristal protein Bt telah diisolasi dan dikarakterisasi. Gen ini disebut gen cry yang merupakan singkatan dari kata crystal. Kristal endotoksin Bt dikelompokkan menjadi lima kelas utama berdasarkan homologi sekuen asam amino pada terminal N, bobot molekul, dan aktivitas insektisidalnya. Kelima kelas tersebut adalah (1) cry1 yang menyerang serangga lepidoptera, (2) cryII yang dapat menyerang lepidoptera dan diptera, (3) cryIII yang dapat menyerang koleoptera, (4) cryIV yang da-pat menyerang diptera, (5) cryV yang dapat menye-rang lepidoptera dan koleoptera (Bahagiawati 2000)

Nama :Aben Candra

NPM   :E1J010070

Dosen :Ir. Marulak S, M.Sc Phd